Jalil Lespert est le fils de l'acteur Jean Lespert, né en 1942 à Rosny-sous-Bois, et de Farida Azi, avocate d'origine algérienne née en 1948 à Palestro (aujourd'hui Lakhdaria), en Algérie. Il est le frère aîné de l'acteur Yaniss Lespert.
Poussé par sa mère, avocate, Jalil Lespert entame des études de droit, mais il change d'avis lorsqu'en 1995, Laurent Cantet le remarque et le lance avec son père dans le court métrage Jeux de Plage. Par la suite, le jeune acteur retrouve le réalisateur pour tourner le téléfilm Les Sanguinaires en 1997. Deux ans plus tard, Laurent Cantet lui propose un nouveau rôle, cette fois au cinéma, dans le film Ressources Humaines. Grâce au rôle de Franck, il se révèle au grand public et remporte le César du meilleur acteur masculin en 2001. En 2003, il remporte le prix de la meilleure révélation masculine au Festival de Cabourg pour son rôle dans Vivre me tue de Jean -Pierre Sinapi. Dès lors, l'acteur enchaîne les films (Pas sur la bouche, Le Promeneur du Champ-de-Mars, Virgile, Le petit Lieutenant…).
Jalil Lespert se démarque également en tant que réalisateur. En 2007, il passe derrière la caméra et signe le long-métrage 24 mesures. Quelques années plus tard, il réitère l'expérience avec l'adaptation du roman Contrary Winds, qui reçoit un bon accueil. En 2014, il co-écrit et réalise le biopic consacré à Yves Saint-Laurent, interprété par Pierre Niney. En 2015, il rejoint l'équipe des réalisateurs de la série Versailles, diffusée sur Canal+, qui connaît un grand succès. Il poursuit l'année suivante avec la production du long métrage Iris dans lequel il joue également. Depuis, Jalil Lespert alterne entre sa carrière de réalisateur et celle d'acteur. En 2020, il joue dans La terre des hommes de Noël Marandin et L'Enfant rêve de Raphaël Jacoulot.
Côté vie privée, Jalil Lespert partage la vie de Sonia Rolland depuis 2009. Le couple a une fille, Kahina, née en novembre 2010. De son union avec l'actrice Bérangère Allaux, l'acteur a deux enfants, un garçon prénommé Aliosha et une fille, Géna. En octobre 2018, il annonce sur les réseaux sociaux être séparé de Sonia Rolland. Le 15 décembre 2020, il officialisait sa relation avec la veuve de Johnny Hallyday, Laeticia, sur Instagram. Jalil Lespert est l'ambassadeur de l'ONG Plan International (droits de l'enfant dans les pays en développement). En 2016, Jalil Lespert était membre du jury du Festival du film britannique de Dinard 2016.
